I型糖尿病患者移植多能干细胞来源的胰腺内胚层细胞可分泌葡萄糖反应性C肽

      糖尿病是一种慢性疾病，影响全球超过4.6亿人，并给全球卫生保健系统和患者带来巨大的财务、残疾和死亡风险。每年诊断出近130,000例新的I型糖尿病病例，患者终生需要外源性胰岛素治疗。2000年，加拿大埃德蒙顿开发了一种胰岛移植方案，该方案成功地使7名I型糖尿病患者摆脱了胰岛素依赖。自此全球已进行了1,500多次胰岛移植手术，2007年至2010年，在临床胰岛移植登记处注册的患者中有44%在移植后3年摆脱了胰岛素依赖。中位HbA1c水平下降超过1.5%，87.5%在移植后1年实现HbA1c控制目标，减少了急性低血糖事件和慢性并发症进展的风险。尽管有这些令人鼓舞的发现，但由于胰岛捐赠者缺乏，该方案的推广仍然有限。除了猪胰岛、开发胰岛素分泌细胞系和对原位细胞基因编辑之外，人类多能干细胞在成为大规模胰岛素生产细胞的临床选择方面取得了巨大进展。2001年，阿萨迪等人报道了人多能胚胎干细胞（ESC）的自发体外分化，包括分化成为分泌胰岛素的胰岛β细胞。基于胰腺发育的先验知识，创建了逐步方案引导ESC分化为内胚层，然后是胰腺内胚层细胞。胰腺内胚层细胞 (PEC)，标记有转录因子同源蛋白Nkx-6.1和胰十二指肠同源框蛋白-1 (PDX1) ，产生的胰岛素很少，但可以在植入小鼠后充分分化成胰岛细胞，并防止内源性小鼠β细胞破坏后发生高血糖，以及逆转已确定的糖尿病。

2014年，ViaCyte启动了一项1/2期前瞻性、多中心、开放标签试验，以调查其候选产品VC-01的安全性、耐受性和有效性。VC-01是储存在封装设备中的PEC细胞组合，并且使用了一个细胞防水层实现免疫保护效果。目前尚未公布完整结果，报道的前19名患者对该产品的耐受性良好，几乎没有并发症。但由于对封装装置的异物反应，细胞存活率不一致，尽管植入2年后在一些移植物中发现了胰岛素免疫反应性细胞，没有报告胰岛素分泌的证据。

2017年，ViaCyte启动了一项后续试验，研究在非免疫保护设备中封装的PEC细胞（PEC-01）的安全性、耐受性和C肽分泌情况。这种方法需要使用免疫抑制剂来限制同种异体免疫和对植入细胞的自身免疫反应。研究者从该试验的单个站点展示了研究者的初步结果，并提供证据表明PEC-01在植入后26周内存活并分化为葡萄糖反应性胰岛素分泌细胞，患者在目标血糖区间维持了更长时间。这些发现支持这样的结论，即放置在血管化封装装置中的PEC-01皮下移植到I型糖尿病患者时可以存活并分化为功能性β细胞。

结果：

1、基线信息分析

患者接受了入组筛查，并在2017年11月至 2020年3月期间入组。患者被诊断患有糖尿病10-54年，男女性皆有（男性=7，女性=8），年龄在36至56岁之间，主要为白人（n=14），并且有程度不同的糖尿病慢性并发症。随访第一年，所有患者均报告了不良反应（共175例），其中严重不良反应3例。患者对预定临床检查的依从性为100%（由于2019年冠状病毒病大流行而取消了一些就诊），学术研究团队错过了五次就诊，导致数据丢失。4小时混合膳食耐受试验的6次就诊中，由于血糖升高(n=4)、不适反应(n=1)或样本采集困难(n=1)，部分患者未完成完整测试。在指定的随访中，对患者称体重并报告他们的低血糖意识评分，患者体重稳定并在随访期间改善了低血糖意识评分。患者HbA1c也受到监测，并且在研究期间保持稳定，所有监测点HbA1c <7.0%。从入组评估到植入后26周，患者肌酐水平稳定。在整个研究过程中记录了患者每日胰岛素需求量，在植入后患者胰岛素需求减少，如果排除移植后类固醇激素相关的胰岛素升高的影响，在整个研究过程中胰岛素需求显著降低。绝对空腹血清C肽和胰岛素需求之间没有关联，C肽和胰岛素的变化也没有任何关联。一名患者在植入1年内胰岛素需求减少>50%，没有患者能够摆脱胰岛素依赖性。

2、葡萄糖反应性C肽分泌

从基线到植入后39周，收集空腹血清样本进行C肽分析和葡萄糖测定，采集周数对空腹血糖没有影响。研究者评估了C肽是否随时间增加，研究者的模型考虑了患者异质性，包括允许C肽基线可变，以及在每个时间点血糖都不一样，并且使用了组间平均中心葡萄糖。时间对C肽有显着影响，但周数和血糖对C肽没有交互作用，提示C-肽和血糖的关系不随时间变化。在补充分析中，研究者评估了患者年龄、性别、植入细胞的体积或胰岛素泵对C肽水平是否有影响。年龄和周数对C肽存在交互作用，年龄越大的患者，在研究中C肽的水平越高，延续时间越长。此外，与每日多次注射胰岛素的患者相比，使用泵的患者在研究期间C肽增加更显著。在其他模型中，随着时间的推移，C肽仍有显着增加，但性别、细胞体积和周数对C肽没有交互作用。

研究者分析了频繁简化口服膳食挑战测试，以确定患者是否以及何时出现快速的膳食反应性C肽分泌，试图剖析发育的时间表。值得注意的是，参与者内部对膳食的血糖反应高度异质。首先，研究者评估了在研究期间的任意时间点血清C肽是否存在膳食反应性升高，发现患者没有快速的膳食反应性C肽产生。接下来，研究者运行了一个多级模型，评估膳食和周数对C肽的交互影响，以确定膳食反应是否随时间增加。研究者的模型显示患者在研究期间出现餐后C肽增加，但时间对膳食反应没有影响。最后，考虑到整个研究中血糖异质性，研究者评估了周数和血糖的交互作用，以确定患者在研究期间是否有更高水平的葡萄糖刺激性C肽。考虑到血糖水平是变化的，尽管患者的快速膳食反应C肽没有增加，但研究者发现患者在研究期间都有C肽和血糖-C肽之间的关系增加，表明葡萄糖反应性C肽分泌的发生。

研究者比较了基线、第26周和第52周的数据，评估4小时混合膳食测试期间膳食反应性C肽的变化。鉴于主要终点是植入26周时C肽的产量，研究者首先确定患者在26周时是否存在膳食反应性C肽分泌。植入前，膳食对C肽分泌没有影响。相反在第26周，餐后数小时内C肽的膳食反应呈显着阳性。

3、免疫抑制效果

将含有PEC-01的装置植入非免疫保护性封装装置中，根据胰岛移植的方案对患者进行免疫抑制。研究者通过评估外周血中T细胞亚群绝对数量和比例的变化来研究患者的免疫学变化，患者在免疫诱导治疗后CD3+T细胞数量减少，CD4+、CD8+、常规T细胞和T调节细胞(Tregs)的数量同样减少，CD4+与CD8+T细胞的比例总体下降。然而，患者的Tregs与常规T细胞的比例增加，以及Helios+ Tregs的短暂增加。PD1highCD4+、PD1highCD8+ T细胞、效应记忆CD4+和CD8+ T细胞的比例增加，幼稚CD4+和CD8+T细胞的比例减少。中枢记忆CD4+T细胞的比例没有变化，但中枢记忆CD8+T细胞的比例出现延迟降低。值得注意的是，产生IL17A的CD4+ T细胞的比例短暂增加，但产生IL2的CD4+和CD8+ T细胞减少，而产生IFN-g的CD4+ T细胞没有变化。研究者使用激活诱导的标记测定法研究了胰岛素原反应性CD4+ T细胞的比例是否发生了变化，但没有观察到随时间的显着变化。

4、膳食反应性C肽是否来源于植入的干细胞

鉴于患者在植入后出现膳食反应性C肽分泌，研究者确定了植入的干细胞是否是C肽的来源。首先，研究者明确了患者在完全取出所有装置后是否还能产生C肽。两名患者在移植物取出后完成了混合膳食耐受性测试，C肽水平皆等于或低于移植前水平。接下来，研究者确定了移植物是否含有存活的表达成熟β细胞表型的细胞。研究者对负载细胞的设备进行了免疫组织化学染色，每个装置三个切片，所有设备都包含胰腺组织、血管和纤维组织背景，但胰腺组织数量高度异质化，组织泡沫细胞的存在可以作为外科手术导致的局部炎症和出血的证据。

第02-10患者中观察到，胰腺组织中分化成内分泌细胞的比例与第26周时混合膳食耐受试验中C肽产量的曲线下面积相关。研究者针对胰腺组织类型、内分泌细胞和成熟β细胞的标志物进行免疫染色，对移植物组成和移植细胞的成熟度进行了详细评估。使用人类胰腺作为对照，载有细胞但从未植入的装置 (n = 4) 包含所有三种胰腺细胞谱系，主要是内分泌组织和导管组织，但很少有腺泡细胞。移植后，移植物（n=10）是异质的，研究者观察到分散的CK19阳性导管样结构被突触素阳性细胞群包围。此外，在低细胞数量的装置中，只有9个存在对胰腺细胞谱系具有免疫反应的细胞，在组织切片间发现了预期的异质性。不同于未植入装置，它们胰岛素、胰高血糖素或生长抑素免疫反应缺失，植入装置存在对胰高血糖素强阳性的内分泌细胞群，以及对胰岛素没有免疫反应的细胞，但是对胰岛素有免疫反应但对胰高血糖素没有免疫反应的细胞比例显着降低。在第26周混合膳食耐受试验中，胰岛素-胰高血糖素免疫反应性细胞的比例与患者C肽曲线下面积之间没有关联。植入前PEC-01具有广泛的PDX1和NKX6.1免疫反应性，而在移植物中，明显的核免疫反应仅限于胰岛素免疫反应细胞。同源框蛋白Nkx-2.2的免疫反应存在于两个移植物中的胰岛素免疫反应细胞和其他不产生胰岛素的内分泌细胞中。移植细胞中PDX1、NKX6.1和 NKX2.2免疫反应的胰岛素反应细胞的比例与人胰腺相似。此外，未植入的胰岛素免疫反应细胞几乎没有肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A (MAFA)免疫反应性，而取出的细胞具有更高水平的MAFA，但具有MAFA免疫反应性的胰岛素免疫反应细胞的比例仍低于成人胰腺。在第26周混合膳食耐受试验中，具有核MAFA免疫反应性的胰岛素免疫反应性细胞比例与患者C肽曲线下面积之间没有关联。最后，研究者评估了细胞增殖水平并观察到植入前具有高水平的增殖细胞核抗原(PCNA)或KI-67阳性的细胞，移植后细胞的PCNA和KI67的反应率与成熟人胰腺相似。

5、治疗效果和不良反应

文献报道20%的外源性胰岛素患者达到了血糖控制目标，但在本研究的胰岛移植方案中，几乎90%的患者达到了血糖控制目标，改善了生活质量，并且没有发生严重的低血糖事件。PEC-01细胞的植入耐受性良好，两例严重不良事件已被证明与免疫抑制方案有关，并且似乎与细胞产品植入皮下无关。临床前研究结果表明，超声和病理检查证实没有证据表明畸胎瘤形成，并且PEC-01衍生细胞似乎属于胰腺谱系，细胞复制率很低。研究者首次描述了I型糖尿病患者，通过植入干细胞衍生的胰岛素分泌细胞，产生膳食刺激的C肽。研究者确认存在对成熟β细胞标志物（包括转录因子MAFA）具有免疫反应性的胰岛素产生细胞，并证明在移植物取出后膳食反应性C肽停止分泌，从而降低了替代性C肽来源的其他可能。在长达1年的随访期间，患者的胰岛素需求减少了20%，在目标血糖范围内维持的时间增加了13%，平均HbA1c <7.0%。但是没有患者能够摆脱胰岛素依赖性。 

有一点对评估未来研究的最大潜能至关重要，移植物具有异质性，胰岛素-胰高血糖素的比值在0.06-0.46之间，与小鼠临床前研究相比，PECS在人类中更倾向于分化为α细胞,而不是β细胞。早期内分泌方向分化，如植入前设备中高比例的突触素免疫反应性细胞，或许有利于α细胞方向分化。研究者以前已经观察到，与大鼠相比，使用不同方案衍生的PECs植入小鼠时，也可能偏向于分化为α细胞而不是β细胞，后续在甲状腺功能减退小鼠中也观察到类似结果。鉴于糖尿病患者体内胰高血糖素生产失调，例如缺乏葡萄糖对胰高血糖素分泌的抑制，过度分化的PEC-01s变成胰高血糖素分泌细胞可能会阻碍PEC-01s调节患者血糖的能力。尽管一部分取出的β细胞的MAFA免疫反应与正常成人胰腺细胞相似，但取出的移植物中许多MAFA免疫反应率较低，这表明产生胰岛素的细胞不是完全成熟的β细胞。需要进一步优化PEC产品和研究影响植入PEC分化为内分泌细胞的宿主因素，以确保更大比例的PEC分化为成熟的MAFA免疫反应性胰岛素分泌β细胞。

研究者首次提供证据表明干细胞衍生的PEC-01可以在I型糖尿病患者体内成长为葡萄糖反应性、分泌胰岛素的成熟β细胞。患者在植入PEC-01后出现膳食反应性C肽分泌，并且移植物含有具有成熟β细胞表型的胰岛素免疫反应细胞。在这项开放标签的1/2期试验中，患者耐受细胞疗法，没有发生细胞产品引起的严重不良事件，并且减少了胰岛素需求，改善了血糖控制，并提高了患者的低血糖意识。这些早期发现支持未来对糖尿病细胞治疗的投资和调查。

研究的局限性

这篇文章报告了一项没有对照组的早期开放标签1/2期临床试验。鉴于干预措施不受控制并且不设盲，研究者无法果断地确定独立研究成分对患者结果的作用。这包括确定临床结果改善是由于干细胞移植物的分泌产物还是由于定期随访的强化。除了临床结果之外，另一个限制是干细胞移植物的表征和研究范围。根据临床试验注册方案，所有移植物都是福尔马林固定的，来自移植物内免疫组化染色的数据表明这些切片代表移植物的一到三个区域。鉴于单个设备植入和多个设备植入之间存在预期的显著异质性，研究者无法估算移植物中的总细胞质量。 异质性的移植物的表型不完整限制了研究者对移植质量和循环C肽水平之间的潜在关系的确定。最终的结果显示高度的异质性，尽管这是在最大的临床试验地点对糖尿病患者进行的最大规模的干细胞临床试验，样本量还是限制了研究者检测潜在调节变量的能力。