基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）

一、前言 

近年来，随着基因修饰技术的迅速发展，基因修饰细胞治疗产品已成为医药领域的研究热点。由于基因修饰细胞治疗产品物质组成和作用方式与一般的化学药品和生物制品 有明显不同，传统的标准非临床研究策略和方法通常并不适用于基因修饰细胞治疗产品。为规范和指导基因修饰细胞治疗产品非临床研究和评价，在《细胞治疗产品研究与评价技 术指导原则》（试行）基础上，根据目前对基因修饰细胞治疗 产品的科学认识，制定了本指导原则，提出了对基因修饰细 胞治疗产品非临床研究和评价的特殊考虑和要求。随着技术的发展、认知程度的深入和相关研究数据的积累，本指导原则将不断完善和适时更新。 

二、适用范围

本指导原则适用于基因修饰细胞治疗产品。基因修饰细 胞治疗产品是指经过基因修饰（如调节、替换、添加或删除等）以改变其生物学特性、拟用于治疗人类疾病的活细胞产品，如基因修饰的免疫细胞，基因修饰的干细胞及其来源的 细胞产品等。 

三、总体考虑 

非临床研究是药物开发的重要环节之一。对于基因修饰 细胞治疗产品，充分的非临床研究是为了：（1）阐明基因修饰的目的、功能以及产品的作用机制，明确其在拟定患者人群中使用的生物学合理性；（2）为临床试验的给药途径、给药程序、给药剂量的选择提供支持性依据；（3）根据潜在风 险因素，阐明毒性反应特征，预测人体可能出现的不良反应， 确定不良反应的临床监测指标，为制定临床风险控制措施提供参考依据。因此，应充分开展非临床研究，收集用于风险获益评估的信息，以确立拟开发产品在目标患者人群中预期 具有合理的、可接受的获益风险比，同时为临床试验的设计和风险控制策略的制定提供支持性依据。 细胞经基因修饰后会改变其生物学特性，同时也会带来新的安全性风险，如基因编辑脱靶风险、载体插入突变风险、载体重组风险、表达的转基因产物的风险等。在制定非临床研究计划时，除参考《细胞治疗产品研究与评价技术指导原 则》（试行）中的对细胞治疗产品的一般要求外，还应具体问题具体分析，基于产品特点和目前已有的科学认知，结合拟定适应症、患者人群、给药途径和给药方案等方面的考虑，科学合理的设计和实施非临床研究，充分表征产品的药理学、 毒理学和药代动力学特征。在进行获益风险评估时，还应重点关注由非临床向临床过渡时非临床研究的局限性和风险 预测的不确定性。 

四、受试物 

非临床研究所用受试物应可代表临床拟用样品的质量和安全性，关键性非临床研究应尽可能采用临床拟用基因修饰细胞治疗产品作为受试物。体外、体内非临床研究所 使用的样品均应符合相应开发阶段的质量标准要求。若后续制备工艺发生变更，应阐明非临床使用样品与临床拟用样品的异同及其对人体有效性和安全性的可能影响。 在某些情况下，受种属特异性的限制，可考虑采用替代产品（表达动物同源基因的人源细胞产品或动物源替代细胞产品）。替代产品应与临床拟用产品采用相似的生产工艺，并对可能影响有效性和安全性的关键质量参数进行对比研究，以评估替代产品与临床拟用产品的质量相似性及 其对非临床数据预测性的影响。 

五、动物种属/模型选择 

进行非临床体内研究时，应尽可能选择相关的动物种属 /模型。基因修饰细胞应能以其预期的作用方式在所选择的动 物中表现出所期望的功能活性。因此，选择相关动物时需要 考虑产品的特性以及临床拟用情况，包括但不限于以下因素：（1）动物对基因修饰细胞及转基因表达产物的生物学反应 与预期的人体反应的相似性；（2）动物对异种来源的基因修 饰细胞的免疫耐受性；（3）动物病理生理学特征与拟用患者人群的相似性；（4）临床拟用递送/给药方式的可行性。由于免疫排斥反应以及细胞和/或转基因的种属特异性，常规实验动物很可能并不适用，而免疫缺陷动物、转基因动物或采用同源替代产品作为受试物可能会更合适。对于某些作用机制涉及与疾病环境相互作用的基因修饰细胞（例如 Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T 细胞），采用疾病模型动物可能会提供有用的信息。每种动物种属/模型均有其优点和不足，没有一种模型可全面预测基因修饰细胞在患者人群中的有效性和安全性。在选择动物种属时，应评估所采用的动物种属/模型与人体的相关性和局限性。若有多种相关动物模型，且这些模型可提供互补的证据，建议采用多种动物/模型开展研究。当缺少相关动物模型时，可采用基于细胞和组织的模型（如二维或三维组织模型、类器官和微流体模型等）为有效性和安全性的评 估提供有用的补充信息。 

六、非临床有效性与概念验证 

对于基因修饰细胞治疗产品，应参照《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》（试行）的要求进行药效学研究。 此外，还应进行概念验证试验，阐明对细胞进行基因修 饰的理由和可行性。通常，对细胞进行基因修饰的理由可能包括但不限于：（1）引入突变基因的功能拷贝以纠正遗传性疾病；（2）改变/增强细胞的生物学功能；（3）引入一个安全开关，以在必要时能够清除细胞。应根据基因修饰的目的， 进行相应的体外和体内验证试验。概念验证试验评估终点可能包括：（1）对细胞基因组修 饰的特异性；（2）引入的外源调控序列对内源基因表达的影响，或转基因的表达及功能活性；（3）基因修饰对细胞生物 学特性和生理功能的影响。设计概念验证试验时，应考虑设 置合适的平行对照，如未修饰的细胞。 虽然体外试验可在一定程度上验证基因修饰细胞的设计理念和拟定作用方式，但对于功能复杂的活细胞，仅依靠体外试验并不足以预测基因修饰细胞的体内行为和功能。因此，除非有充分的理由，均应尽可能考虑进行体内概念验证试验。在设计体内概念验证试验时，建议采用疾病模型动物。 对于预期在人体内会长期存续或长期发挥功能的基因修饰细胞，如果缺乏相关的动物模型，建议采用替代方法评估基因修饰细胞的潜在长期效应，如采用替代产品进行体内概念验证试验，在足够的、可行的时间窗内评估基因修饰细胞的长期效应。 

七、非临床药代动力学 

参考《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》（试行）中的对细胞治疗产品药代动力学的一般要求，采用相关动物 模型开展药代动力学试验以阐明基因修饰细胞在体内的命 运和行为（包括生物分布、迁移、归巢、定植、增殖、分化和存续性）。这些试验可以单独开展，也可以整合到概念验证 试验和/或毒理学试验中。 若基因修饰细胞表达的转基因产物可分泌到细胞外，应阐明其在局部和/或全身的暴露特征及免疫原性。

八、非临床安全性 

（一）一般考虑

由于不同基因修饰细胞治疗产品的细胞的来源、类型、 生物学特性、基因修饰方式/技术、生物学功能/作用方式、生产工艺、非细胞组分等各不相同，在制定非临床安全性评价策略时，除参考《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》 （试行）中对细胞治疗产品的一般要求外，还应基于每个产品的特点，具体问题具体分析。在制定非临床安全性评价策 略时，考虑因素包括但不限于：（1）临床拟用适应症、目标 患者人群和临床给药方案；（2）细胞的来源、类型及其在体 内的细胞命运；（3）基因修饰目的、方式及技术；（4）作用 方式/机制或预期的功能活性；（5）诱导免疫应答/免疫耐受； （6）产品的质量因素；（7）已有的非临床/临床数据；（8）类似产品的已知有效性和安全性信息。 基因修饰细胞治疗产品的非临床安全性研究一般应当在经过药物非临床研究质量管理规范（GLP）认证的机构开展，并遵守药物非临床研究质量管理规范。对于某些采用特殊动物模型、药理毒理整合性研究、特殊指标检测等非常规试验内容，可以考虑在非 GLP 条件下进行，但应保证数据的质量和完整性。 

（二）转基因表达产物的风险评估 

通常，转基因会随基因修饰细胞的存在而持续表达，对于有复制能力的细胞，转基因还可能会随细胞的增殖而过度 表达，导致基因表达产物的蓄积，进而导致毒性。因此，若基因修饰细胞编码表达转基因产物，应在体内试验中评估转基因表达产物的毒性风险。在设计试验时，应根据转基因的 表达情况和功能活性设计试验期限和必要的终点指标，考虑因素包括：（1）基因表达水平和持续时间；（2）基因表达产 物的分布部位；（3）基因表达产物的功能活性。 一些转基因产物（如生长因子、生长因子受体、免疫 调节物等）若长期持续表达，可能会存在长期安全性风险， 如导致细胞非受控的生长、恶性转化等不良反应。因此，对于长期持续表达或具有长期效应的转基因修饰细胞，非临床安全性研究的期限应足以评估其长期安全性风险。为确定基 因表达产物的量效关系，解释预期和非预期的试验结果，建议在试验中伴随对转基因表达水平的定量检测以及免疫原性检测。 

（三）插入突变风险评估 

一些整合性载体（如逆转录病毒、慢病毒、转座子）可将外源基因插入整合到细胞基因组中，这可能会导致关键基 因突变或激活原癌基因，从而导致恶性肿瘤风险增加。 影响插入突变的关键风险因素包括：（1）载体的整合特征，如插入位点的偏好性；（2）载体的设计，如增强子、启动子等构建元件的活性，影响邻近基因的潜力；产生剪接突变体的潜在剪接位点或多聚腺苷酸信号等；（3）细胞载体拷贝数；（4）转基因表达产物的功能活性（如与细胞生长调控相关）和表达水平；（5）靶细胞群的转化可能性，这可能与细胞 的分化状态、增殖潜力、体外培养条件和体内植入环境等有 关。 基于已有科学经验和既往非临床/临床研究结果，如果认 为基因修饰细胞所采用的载体系统可将外源基因整合到细 胞基因组中并可在体内长期存续，需综合分析以上风险因素， 评估潜在的插入突变、致瘤/致癌性风险。非临床研究，应采用具有代表性的基因转导细胞进行基因整合位点分析，分析 细胞的克隆组成以及在关注基因（如肿瘤相关调控基因）附 近有无优先整合迹象，含有关注整合位点的细胞有无优先异常增殖。

九、对特定类型基因修饰细胞产品的特殊考虑

鉴于基因修饰细胞的产品种类繁多、各有特点，除上述 一般技术要求外，还应基于产品的特性进行相应的特殊考虑。 本指导原则列举了以下三种情形的特殊考虑。 

（一）CAR或TCR修饰的免疫细胞 

对于嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）或 T细胞受体（T cell receptor，TCR）修饰的免疫细胞，应尽可 能采用多种方法评估其靶点相关毒性和脱靶毒性风险。 对于靶点相关毒性，应采用体外方法深入分析靶点在人体器官、组织和细胞中的表达分布情况，基因表达分析库和文献调研也可能会有助于阐明靶点在不同病理生理状态下 的表达是否存在差异。应采用表达和不表达靶抗原的细胞作为靶细胞进行体外试验，确认CAR或TCR修饰的免疫细胞可 特异性的识别和杀伤靶细胞。 对于CAR修饰的免疫细胞，应采用多种体外方法评估其 胞外抗原识别区的脱靶风险。 TCR修饰免疫细胞的脱靶毒性可通过评估TCR与人体自身抗原肽的交叉识别能力来评估。首先，应采用体外试验测定TCR修饰的免疫细胞与人自身抗原肽-HLA（与递呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）复合物的亲和力，并说明抗原肽的 选择依据及选择范围。此外，还应研究其他相关或不相关的 蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR与人自身抗原肽有交叉反应可能，应确定靶抗原肽的最小识别基序（motif），并采用计算机预测分析评估交叉反应性。如果计算机预测可识 别出具有潜在交叉反应性的抗原肽，应在体外测定TCR修饰 免疫细胞对表达相应蛋白或递呈相应抗原肽的的细胞的识 别能力。如果不能排除交叉反应性，应基于含有潜在交叉反 应性抗原肽的蛋白的表达模式以及TCR与潜在交叉反应性抗 原肽的亲和力来进行风险评估。为获得TCR与其他等位HLA 潜在交叉反应性的信息，应进行充分的HLA交叉反应性筛选。 对于TCR修饰的T细胞，还应关注引入TCR链和内源性TCR之间的错配可能性，应描述和说明旨在降低错配可能性的TCR设计策略。 

（二）诱导多能干细胞来源的细胞产品 

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS）自身具有致瘤性风险，在体内可形成畸胎瘤，整合病毒载体的 使用和诱导多能性可能增加iPS细胞插入致突变性和致癌性的风险。因此，应在首次临床试验前完成致瘤性试验。若设计科学合理，能够满足评价要求，也可在持续时间足够长的毒性研究中评估致瘤性风险。体内致瘤性试验建议采用掺入未分化iPS细胞的细胞产品作为阳性对照，以确认实验系统的灵敏度。如果iPS细胞设计了自杀机制以降低致瘤风险，应在体内试验中确认/验证此类自杀机制的功能重编程可能会诱导细胞的表观遗传学改变，其后果尚不 完全清楚。为评估iPS细胞衍生细胞的表观遗传学改变所引起 的潜在异常特征，应采用体外和/或体内非临床研究来阐明细 胞具有适当的行为和生理功能，毒理学试验还应评估细胞异 常行为引起的不良反应。应结合质量表征数据、非临床安全 性数据以及文献数据进行深入的风险评估，并就旨在保护患 者安全的风险减轻措施进行讨论。如果发现遗传学和/或表观 遗传学改变，应解决相应的安全性问题。 

（三）采用基因编辑技术制备的细胞产品 

对于采用基因编辑技术制备的基因修饰细胞产品，应进行体外在靶和脱靶活性评估，以确认修饰酶或向导RNA对靶 基因序列的特异性。在评估基因编辑的脱靶风险时，应说明所选择的评价策略的合理性和敏感性。虽然采用计算机分析预测基因编辑的潜在脱靶位点，并对潜在脱靶位点进行深度测序分析，可用 于评估基因编辑的脱靶风险；但选择的评价策略仍应包含体外全基因组测序比对，以证明潜在脱靶位点未出现脱靶。此外，在评估脱靶活性时，还应评估种属特异性的差异、细胞 病理生理状态的差异或细胞类型的差异对非临床数据预测 性的影响。必要时，还应分析基因编辑对细胞表型和生理功能的潜在影响。